NHỮNG LỖI THƯỜNG GẶP KHI CHẠY PHẢN ỨNG PCR 

🔬 1. Không có sản phẩm PCR (no band)

Nguyên nhân có thể:

• Sai nhiệt độ biến tính, bắt cặp, kéo dài.
• Thiếu một hoặc nhiều thành phần (mồi, enzyme, dNTP, DNA khuôn…).
• DNA khuôn bị phân hủy hoặc nồng độ quá thấp.
• Mồi không đặc hiệu hoặc thiết kế sai.
• DNA quá cao hoặc quá thấp cũng ức chế PCR-không có sản phẩm (10ng/uL - 50ng/uL).

Khắc phục:

• Kiểm tra kỹ thành phần phản ứng.
• Tối ưu điều kiện nhiệt độ và thời gian từng bước.
• Kiểm tra chất lượng và nồng độ DNA/mồi bằng Nanodrop hoặc gel.
• Thiết kế lại primer.
• Nồng độ DNA cao sẽ pha loãng xuống, nồng độ thấp tăng lượng mẫu đầu vào.

⚠ 2. Có nhiều dải không đặc hiệu (multiple bands)

Nguyên nhân:

• Mồi gắn không đặc hiệu do nhiệt độ annealing quá thấp.
• Mồi có vùng tự bổ sung (dimer).
• Quá nhiều chu kỳ PCR hoặc enzyme quá nhiều.

Khắc phục:

• Tăng nhiệt độ annealing hoặc dùng gradient PCR.
• Tối ưu nồng độ mồi, Mg²⁺.
• Giảm số chu kỳ PCR.
• Sử dụng mồi thiết kế tốt hơn (kiểm tra bằng phần mềm như Primer-BLAST, OligoAnalyzer).

 3. Dimer mồi (primer-dimer)

Nguyên nhân:

• Mồi có vùng bổ sung nhau ở đầu 3’.
• Nồng độ mồi quá cao.

Khắc phục:

• Thiết kế lại mồi tránh vùng tự bổ sung.
• Giảm nồng độ mồi xuống 0.1–0.2 µM.
• Sử dụng hot-start Taq để hạn chế phản ứng không đặc hiệu ở nhiệt độ phòng.

 4. Băng mờ, yếu (faint band)

Nguyên nhân:

• DNA khuôn quá ít.
• Enzyme bị giảm hoạt tính do bảo quản không đúng cách.
• Điều kiện chu kỳ chưa tối ưu.

Khắc phục:

• Tăng lượng DNA khuôn vừa phải.
• Kiểm tra điều kiện bảo quản enzyme (thường ở –20°C).
• Tối ưu chu kỳ và thời gian kéo dài.

 5. Kết quả không ổn định, lặp lại không được

Nguyên nhân:

• Dụng cụ, hóa chất nhiễm bẩn (cross-contamination).
• Pha trộn không đồng đều.
• Không tuân thủ đúng thao tác vô trùng.

Khắc phục:

• Dùng pipet chuyên biệt cho từng bước.
• Sử dụng tủ cấy vô trùng khi chuẩn bị mix.
• Thêm control âm và dương trong mỗi phản ứng

✅ Một số lưu ý để hạn chế lỗi khi chạy PCR:

• Luôn chạy mẫu đối chứng âm (no template control – NTC).
• Pha Master Mix đủ cho tất cả mẫu + dư 5–10% để tránh thiếu.
• Đánh dấu rõ ống, pipet chính xác từng thành phần.
• Ghi chép cẩn thận điều kiện nhiệt độ và kết quả để dễ truy vết nếu cần.